Metode de analiza genetica

Centrul de Reproducere Umana „GENESIS ATENA” colaboreaza cu centre genetice de prestigiu. Aici, aplicam pe scara larga metoda diagnosticarii genetice preimplementare, pentru controlul afectiunilor genetice si depistarea anomaliilor cromozomiale.

Pentru diagnosticul semnelor genetice ereditare sunt folosite metode precum biologia moleculara bazata pe reactia in lant a polimerazei (Polymerase chain reaction – PCR).

Pentru controlul anomaliilor cromozomiale este utilizata pe scara larga tehnica pe citogenetica bazata pe hibridizarea fluorescenta (Fluorescent in situ hybridization – FISH). Insa metoda FISH are un mare dezavantaj: este limitat numarul de cromozomi care poate fi controlat (de obicei, sunt controlati de la 9 pana la 24 de cromozomi), fara a da o imagine clara legata de starea cromozomilor embrionului.

Incepand din 2010, am pus in aplicare o noua tehnologie care ajuta cuplurile ce se incadreaza in aceasta categorie, respectiv controlul genetic preimplantar al cromozomilor prin metoda de hibridizare genomica comparativa a ADN-ului (CGH – Array), prin care sunt controlate 23 perechi de cromozomi, atat cat cuprinde celula umana. Cu ajutorul acestei metode pe care o folosim la „GENESIS ATENA”, primii copii sanatosi din Grecia s-au nasc

Diagnosticul genetic preimplemantar este realizat in perioada dintre fertilizare si transferul embrionar. La fiecare etapa de fertilizare in vitro, se provoaca stimularea ovariana a femeii cu ajutorul terapiei medicamentoase, dupa care urmeaza extragerea ovocitelor cu indrumare ecografica si prelucrarea lor in laborator. In continuare, se realizeaza fertilizarea ovocitelor cu materialul seminal al sotului, prin tehnica de injectare a spermatozoizilor in interiorul ovulelor si prin recoltarea ovulelor fertilizate in laborator.

Modalitatea prin care se efectueaza diagnosticul genetic preimplementar implica efectuarea biopsiei embrionului in laboratorul de fertilizare in vitro.

Pentru diagnosticarea afectiunilor genetice, se vor recolta cateva celule de la embrion, cu scopul de a fi supuse analizelor genetice.

Biopsia celulelor se face cu ajutorul unui laser special conectat la microscop. Aceasta procedura ajuta la recoltarea in siguranta a celulelor din embrion. Biopsia se efectueaza in diferite stadii, in laborator, pe parcursul dezvoltarii embrionului, inainte de transferul embrionar:

1. Corpul polar al ovulului (ziua recoltarii ovocitelor)

2.

Diagnosticul genetic preimplantar se utilizeaza in cazul cuplurilor in care femeile au o varsta fertila inaintata sau exista antecedente de avorturi spontane recurente ori o serie de esecuri repetate de fertilizare in vitro (FIV), pentru verificarea anomaliilor cromozomiale numerice la embrioni, inainte de transferul lor in uter.

In astfel de cazuri, numeroase studii au aratat ca aproximativ 60% dintre ovulele fecundate in etapa canelura (la 3 zile dupa fertilizare) si 40% dintre blastocistii (la 5-6 zile dupa fertilizare) cultivati în laborator prezinta anomalii cromozomiale.

Tinand cont numai de criteriile morfologice, selectia de embrioni pentru transferul embrionar nu este suficienta in unele cazuri, deoarece nu pot fi distinse anomaliile cromozomiale. Asadar, la recomandarea medicului, inainte de transferul embrionar, se poate efectua un diagnostic genetic preimplantar in scopul identificarii anomaliilor cromozomiale la embrioni.

Purtatorii de modificari cromozomiale structurale produc cantitati mari de gameti inegali. Cuplul in care unul dintre parteneri este purtator de anomalii cromozomiale, cum ar translocatiile cromozomiale, inversiunile cromozomiale etc., are un risc crescut de a concepe embrioni cromozomiali anormali, care duc la avorturi spontane recurente sau la conceperea de copii cu defecte congenitale si retard mintal.

Diagnosticul genetic preimplantar (PGD) poate reduce riscul acestor efecte adverse. Cu ajutorul PGD, alegem pentru transferul embrionar doar acei embrioni cu cariotip normal sau care o translocatie cromozomiala echilibrata.

Diagnosticul genetic preimplantar si controlul de histocompatibilitate (HLA typing) sunt metode utilizate in cazul cuplurilor care doresc sa aiba copii sanatosi si care, ulterior, vor deveni potentiali donatori pentru transplant de celule stem pluripotente la fratii care sufera de boli grave.

In 2005, la Centrul de Reproducere Umana Asistata din Grecia, au fost implementate cu succes aceste proceduri pentru o familie cu un copil suferind de de boala cronica granulomatoasa, o afectiune genetica letala, care afecteaza capacitatea organismului de a lupta impotriva infectiilor. Rezultatele au fost publicate intr-o revista stintifica de renume.

De asemenea, pentru prima data in Grecia, am aplicat PGD impreuna cu controlul de histocompatibilitate si in cazul unei familii cu un copil care suferea de anemia celulelor in secera, avand ca rezultat nasterea de gemeni; scopul efectuarii unui transplant de celule stem la fratele lor bolnav a fost indeplinit cu succes.

Pana in prezent, am aplicat aceste metode de diagnosticare genetica preimplantara impreuna cu controlul de histocompatibilitate la 27 de familii si am facut posibil transplantul de celule stem pentru urmatoarele afectiuni: talasemie, anemia celulelor in secera, Fanconi, sindromul Bruton agamaglo

In prezent, diagnosticul de preimplantare este metoda aleasa de numeroase cupluri care sufera de boli ereditare cu sanse mari de transmitere catre copiii lor. Centrul de Reproducere Umana Asistata aplica diagnosticul genetic de preimplantare la  cuplurile care sunt purtatoare de boli genetice ereditare, pentru a identifica embrionii sanatosi. Ulterior, acestia sunt transferati in uter, creandu-se conditiile optime pentru o sarcina.

PGD poate fi aplicat pentru toate bolile genetice, in cazul in care afectiunea genetica  este cunoscuta.  La Centrul de Reproducere Umana Asistata din cadrul clinicii „GENESIS ATHENS” se aplica metoda PGD cu scopul de a fi descoperite cele mai comune afectiuni genetice, cum ar fi talasemia (purtatori: 10% din populatia greaca) si fibroza chistica (purtatori: 5% din populatia greaca), dar si pentru multe alte  afectiuni mai rare (a se vedea Tabelul 1), incluzand aici sindroamele mediteraneene si afectiunile hemoglobinale, boala cronica granulomatoasa, scleroza tuberoasa, hiperplazia congenitala suprarenala, coreea Huntington, boala CADASIL, agamaglobulinemia de tip Bruton, bolile neuromusculare etc.

Cu ajutorul PGD putem impiedica, de asemenea, transmiterea generatiei urmatoare de gene care afecteaza calitatea vietii si reduce speranta de viata, 

Conservarea embrionilor prin crioconservare ofera posibilitatea de a utiliza cu succes embrionii astfel conservați, pentru eventualitatea in care cuplul doreste sa mai aiba si alti copii in viitor.

Prin aceasta metoda, se spera cresterea proportiei de sarcini intr-un singur ciclu de tratament, deoarece ofera femeii posibilitatea de a face transferuri de embrioni in mai multe randuri, cu costuri economice, fizice si emotionale cat mai reduse.

Astfel, cand se executa procedura de recoltare a ovocitelor, embrionii suplimentari pot fi congelati (desigur, doar daca aceasta este dorinta cuplului). Acestia pot fi pastrati prin crioconservare si pot fi transferati ulterior, fara ca femeia sa mai fie nevoita sa urmeze un tratament medicamentos.

Embrionul uman se conserva cu succes , fie in stadiul de pronuclei (zigot), fie imediat dupa diviziunea celulara sau chiar si atunci cand este sub forma blastocist. Embrionii umani se congeleaza prin doua cai:

a) metoda clasica de congelare lenta cu propandiol si zaharoza (in cazul embrionilor) sau glicerol (in

Maturarea ovulelor in laborator este o metoda dezvoltata in ultimii ani pe plan international, cu scopul de a creste sansele unei sarcini, in conditiile in care o femeie, din anumite motive de sanatate, nu poate urma o terapie medicamentoasa pentru stimularea ovariana. Aceasta procedura presupune utilizarea foliculilor primari continuti de ovare. Astfel, femeii i se vor extrage ovocitele mult mai devreme decat in cazul stimularii ovariane (ziua 7-8), iar in laborator sunt prelevate ovule imature, care sunt aduse la maturitate in culturi speciale umede.

Cand acestea ajung la maturitate, dupa 1-2 zile, sunt fertilizate prin injectarea intracitoplasmatica ce contine materialul seminal al partenerului. In continuare,  procedurile sunt asemanatoare celor descrise in cazul fertilizarii in vitro. Sansele de reusita ale acestei proceduri sunt cu siguranta mult mai reduse decat ale fertilizarii clasice, dar reprezinta o alternativa demna de luat in calcul pentru anumite categorii de cupluri care isi doresc un copil.

Tehnica ZIFT (transferul intrafalopian zigotic) este recomandata femeilor care au fost diagnosticate cu endometrioza, cuplurilor cu infertilitate de cauze necunoscute, dar si in cazul in care infertilitatea este cauzata de factorul masculin. Conditia esentială pentru a putea fi utilizata aceasta metoda este existenta trompelor uterine. Aceasta tehnica seamana cu cea anterioara (GIFT), singura diferenta constand in faptul ca se executa la 24-48 de ore dupa recoltarea ovocitelor si dupa ce fertilizarea se efectueaza in prealabil in laborator, iar apoi embrionii sau zigotii sunt amplasati în trompele uterine. Se efectueaza cu anestezie generala si laparoscopic.

In anumite cazuri, se pare ca mediul natural al trompei uterine si diversi factori intrauterini contribuie la dezvoltarea fetala.

Cele doua metode amintite mai sus, GIFT si ZIFT, nu mai sunt utilizate atat de des, ci doar la dorinta expresa a cuplului.